血腦屏障:中樞藥物研發之痛 --- CNS藥物開發中的DMPK評價

張振 藥時代

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文章來源:上海賽默羅生物科技有限公司 作者:張振

2020年8月20日是諾貝爾醫學和生理學獎獲獎者德國科學家保羅•埃爾利希(Paul Ehrlich)博士逝世105周年的日子(1854.03.14 –1915.08.20)。Ehrlich博士除了最為人所知的在免疫學理論和血清療法方面的研究工作外,他還是“血腦屏障”現象首位發現者。1895年Ehrlich博士發現外周注射染料後,腦部並不能被染色,雖然Ehrlich博士當時並未對該現象給出準確的解釋,但他的這一發現直接開啟了後續對血腦屏障(Brain-blood barrier,BBB)的深入研究。



我們現在都知道血腦屏障指的是腦毛細血管壁與神經膠質細胞形成的血液與腦組織之間的屏障。鑒於BBB與藥物是否能入腦直接相關,因此對於BBB的研究包括其結構、功能以及如何克服BBB等方面在學術界與制藥界(尤其是開發中樞神經系統(Central nervous system,CNS)藥物公司)都有著廣泛而深入的研究。


藥物代謝及藥代動力學(Drug metabolism & pharmacokinetics,DMPK)是研究藥物分子在生物體內吸收、分布、代謝和排泄(Absorption, Distribution, Metabolism & Elimination,ADME)的學科,在藥物早期篩選以及後期臨床開發階段都有著重要的作用。因此,筆者想以BBB為切入點,介紹一下DMPK在CNS藥物開發中的作用,希望能給CNS藥物的從業者們一些提示。


想在開篇就聲明一下,本文內容中有很多都是筆者根據個人經驗的一些判斷,難免會有一些主觀偏向和疏漏,非常希望讀者朋友們能指出文中漏洞,也希望能跟大家有深入的交流和探討,歡迎留言。 


1. 中樞類疾病/藥物簡介


中樞神經系統疾病是指影響大腦(Brain)或脊髓(Spiral cord)結構或功能的一組神經障礙,主要包括神經退行性疾病、功能性紊亂、結構性障礙、中樞神經系統感染和脫髓鞘疾病。提到中樞類疾病,其實每個人都能說上幾個,最為人所知的有老年癡呆症(又叫阿爾茨海默症(Alzheimer's disease,AD))、帕金森症(Parkinson's disease,PD)、抑郁(Depression)、精神分裂症(Schizophrenia)、癲癇(Epilepsy)、中風(又叫腦卒中,Stroke),還有在腫瘤領域經常能聽到的原發性腦瘤和腦轉移(Brain metastasis)等。


從更精確的分類上來說,約翰霍普金斯研究所將中樞神經系統的受損劃分為以下幾種情況:


  • 感染:如腦膜炎、腦炎、脊髓灰質炎和硬膜外膿腫;

  • 血管疾病:如中風、短暫性腦缺血發作(TIA)、蛛網膜下腔出血、硬膜下出血和血腫、以及硬膜外出血;

  • 結構性疾病:如腦或脊髓損傷、貝爾麻痹、頸椎病、腕管綜合征、腦或脊髓腫瘤、周圍神經病和格林-巴利綜合征;

  • 功能障礙:如頭痛、癲癇、失眠、神經痛、焦慮、抑郁症;

  • 退化症:如帕金森病、多發性硬化症(Multiple sclerosis,MS)、肌萎縮側索硬化症(Amyotrophiclateral sclerosis, ALS)、亨廷頓舞蹈病(Huntington's disease, HD)、阿爾茨海默病;

  • 腫瘤:如腦部腫瘤、腦癌等。


再說說中樞神經系統藥物(CNS drugs),通常指的是治療功能障礙神經退化症的藥品。這些損傷涉及到神經系統病源性破壞,往往難以治愈,患者必須長期服藥,但隨著基因以及細胞療法的興起,對於諸如帕金森病、ALS以及HD等疾病能實現單次或者長時間間隔給藥而達到臨床治愈的可能[1-3]



2. CNS藥物研發現狀


據聯合國衛生組織估算,全球約有1/6的人口受到神經疾病的困擾。根據研究機構Grand View Research的計算,2016年全球CNS市場規模約為772億美元,並將在未來五年以年化5.9%的速度增長。但相比於其他治療領域,CNS表現出高風險、高收益的特征。高風險主要是因為CNS藥物的研發非常困難,從臨床一期到上市的成功率僅為8.4%。因此,鑒於CNS藥物的開發的高損耗率,許多制藥公司已決定減少CNS研究,有的甚至直接關閉了其CNS藥物研發中心,例如GSK於2017年關閉了中國的神經系統藥物全球研發中心。


具體來說,CNS藥物研發的難點主要在於:
•  很多神經疾病的準確病因至今沒有定論。
藥物只針對“症狀”,難以治療“根源”。這一點在AD領域表現得尤為明顯,例如大家都熟知的Aβ假說在經過了多次失敗後才終於有好消息傳來,渤健(Biogen)和衛材(Eisai)聯合開發的抗體藥物aducanumab近期被FDA授予優先審評(Priority Review)。
• 臨床方案的設計較為困難、臨床效果較難評測,缺乏跟疾病相關的生物標記物(biomarker)。
精神類疾病表征不夠明顯,有些甚至沒有明顯的器質病變,而病人自己匯報的感受往往過於主觀,不夠準確。
•  副作用明顯。
CNS藥物常常伴隨著較明顯的副作用,例如治療抑郁症的藥物,會引起高血壓、自殺傾向等副作用。近幾年多個“明星”新藥因為其副作用過大而無法通過審批。

但值得欣慰的是,盡管CNS藥物的開發面臨諸多挑戰,也還是有一大批堅守者們繼續在這個領域耕耘著,除了國際知名大藥企Biogen、Lilly、BI等,國內也有越來越多的藥企進入到了CNS領域,比如專注於原發性腦瘤/腫瘤腦轉移藥物開發的贊榮醫藥和壁辰醫藥、植根於CNS藥物開發的恩華藥業,也有像筆者所在的賽默羅生物這樣的專注於神經類藥物開發的創新公司。


3. 血腦屏障介紹


3.1 發現歷史

如前言所述,1895年Ehrlich博士在研究染料時意外發現了“血腦屏障”現象,他與其學生埃德溫·戈德曼(Edwin Goldmann)將藍色染料通過靜脈注入動物體內後發現,除了大腦外幾乎所有器官都變成了藍色。隨後,Lewandowski於1900年也觀察到了類似的現象,並首次提出了“血腦屏障(德語“Blut-hirn-schranke”)”這一概念。1913年,Edwin Goldmann為了進一步驗證該屏障的存在,鞘內注射染料後發現僅大腦能被染色,而外周組織則不能。


綜上,經過近20年的研究,對於腦部和外周組織間存在血腦屏障這一事實基本上得到廣泛認可,但當時還沒人知道形成該屏障的原因,直到上世紀60年代電子顯微鏡的出現,科學家能夠直接觀察到所謂的血腦屏障。下面列舉了血腦屏障發現史上的一些裏程碑事件:

  首次發現外周靜脈注射藥物後藥物分子無法到達大腦 (Ehrlich 1885)

  首次提出“血腦屏”障這一概念 (Lewandowski 1900)

  鞘內注射藥物後藥物分子能到達大腦,拓展了最初的“血腦屏障”概念,並首次提出“腦脊液”假說,即鞘內給藥後藥物分子是通過腦脊液進入大腦的 (Goldman 1913)

  首次發現在腦部疾病中顯示出“血腦屏障缺陷”,即在頸動脈內施用高滲溶液後表現出短暫的血腦屏障打開或破壞(Broman 1941)

  電子顯微鏡研究表明,皮層中存在細胞外液 (vanHarreveld 1966)

  發現腦血管內皮細胞之間的“緊密連接(tight junction,TJ)”在血腦屏障中的重要作用 (Reese and Karnovsky 1967)

  采用放射性同位素標記物首次發現己糖、氨基酸和胺等能透過血腦屏障 (Oldendorf 1971)

  血腦屏障的分子生物學研究:葡萄糖轉運蛋白基因的克隆與測序 (Weiler-Guttler et al 1989)

 

3.2 血腦屏障的結構和功能

血腦屏障(Blood-brain barrier,BBB)指腦毛細血管壁與神經膠質細胞形成的血液與腦組織之間的屏障,其主要由血管內皮細胞(Endothelial cells)(細胞之間通過緊密連接(Tight junctions,TJ)和黏著連接(Adherent junctions,AJ)相互聯系)、星形膠質細胞(Astrocytes)、周細胞(Pericytes)、細胞外連續的基底膜和細胞外基質及神經元構成,也包括一些免疫細胞等(見圖1)。


血腦屏障能防止毒素及其他外源有害物質例如藥物分子進入腦內損害神經細胞,同時又能保證對維持腦功能所需物質的攝入和藥物代謝產物的排出,使內環境相對穩定,以維持神經細胞的正常功能。


藥物分子進入腦實質主要通過以下途徑:1)被動擴散(Passive diffusion),大部分小分子化合物都是通過這一途徑透過BBB從而實現入腦,其可能受主動外排(Efflux)的限制;2)通過細胞間隙入腦,該方式通常只能對一些極性低分子量的化合物適用;3)由腦內皮細胞表達的轉運蛋白(Transporter)介導的攝取;4)由腦內皮細胞表達的受體蛋白(Receptor)介導的轉運。對於轉運蛋白以及受體介導的轉運,本文會在4.1.6節做進一步介紹。


圖1 血腦屏障結構及藥物分子進入腦的主要途徑[4]


3.2.1 血腦屏障相關轉運體

BBB實現其阻止外來有害物質進入腦實質的另一個重要因素是BBB相關外排轉運體的參與。圖2列舉了BBB上的常見的藥物轉運相關的轉運體,其中有我們熟知的外排轉運體P-gp、BCRP和MRP家族以及在肝臟也高表達的攝入轉運體OATP家族。


除了限制外源物質入腦,即我們通常所說的藥物或毒物,BBB上也大量表達另一類攝入轉運體來維持營養物質平衡,如Glut1、LAT1和ENT1,分別是葡萄糖轉運蛋白1(Glucose transporter 1,Glut1),主要負責葡萄糖跨膜運輸、L-型氨基酸轉運載蛋白1(Large neutral amino acid transporter 1,LAT1),主要負責轉運大的、中性氨基酸、平衡型核苷轉運蛋白1(Equilibrative nucleoside transporter 1,ENT1),主要負責核苷酸的轉運。


對於此類攝入轉運體,理論上是可以作為藥物靶點開發的,思路大概是先鑒別出僅在BBB高表達的轉運體,然後針對其設計小分子化合物或者抗體藥物來治療腦部疾病,既能實現增加腦部藥物暴露量,又能降低外周毒副作用。


圖2 BBB上主要藥物相關轉運體[5]


3.3 血腦屏障發育過程

與肝臟代謝功能一樣,BBB在新生兒中也未發育成熟。例如,大腦中的P-gp表達在出生時非常有限,會隨著年齡增長而逐步增加,並在約3~6個月時達到成人水平。因為出生後BBB上P-gp的表達量較低,諸如嗎啡這樣的藥物會透過BBB並在大腦中蓄積,並最終帶來毒副作用。

研究發現,母親在哺乳期使用可待因會導致新生兒出現危及生命的阿片類藥物毒性,BBB發育為該臨床發現提供了合理解釋[6]
 
3.4 疾病對血腦屏障的影響

在介紹血腦屏障裏程碑事件的時候已經提到了疾病狀態對BBB會產生影響,即在頸動脈內施用高滲溶液後表現出短暫的血腦屏障打開或破壞。下表總結了常見CNS疾病對於BBB的影響:


表1 常見CNS疾病對BBB的影響[7]


可以看到上表所總結的疾病絕大部分都能降低或者破壞BBB的完整性,比如通過降低TJ和P-gp的表達,或者直接造成BBB發生滲漏,因此可以很自然地想到BBB對於藥物分子的透過性在這些病人上實際是要更大一些的,也確實在臨床上也觀察到相對於動物模型上推測出來的藥物入腦能力,藥物在病人腦部的暴露量會更高。

比如,在發生腦轉移的乳腺癌患者中發現拉帕替尼(為P-gp和BCRP底物,但其在高濃度下又可抑制這兩種外排轉運體)也有較高的腦部暴露量,PET研究也表明,發生腫瘤轉移的腦部拉帕替尼的水平高於正常腦[8]

此外,一些大分子抗體藥物,例如抗腫瘤藥物赫賽汀,也能在腦轉移病人的腦脊液(CSF)中檢測到,蓄積也更高[9],也進一步說明腦部腫瘤會破壞BBB的完整性。

基於這個現象,筆者也曾考慮過對於入腦藥物的開發,其臨床前評價標準是不是可以降低一些?例如,一般對於入腦化合物,要求其臨床前動物上Kp,uu(即遊離藥物在腦部和血液的比值,該值為1說明藥物能自由從血液進入大腦,該值為0說明血液中的藥物分子無法進入大腦)大於0.5,當然這個數值各個公司會有不一樣,但總體原則是越接近1越好,至少是大於0.3。

大家知道,在測定Kp,uu的時候,用的都是健康動物,其BBB是完整的,因此相對於臨床實際,其對於化合物入腦的限制是更為嚴格的,那是不是可以降低臨床前的要求,比如設為0.2或者更低呢?特別是對於一些P-gp的非敏感底物,比如ER值2~4之間,Papp小於10*10-6 cm/s的藥物分子,目前極為嚴苛的臨床前篩選條件是不是把一些可能在臨床會有作用的好分子給誤殺了呢?

關於這個問題,筆者也非常想知道各位讀者的想法,歡迎留言。
 
3.5 血腦屏障的種屬差異

在新藥研發中選擇合適的動物模型對於藥物評價有著至關重要的作用,因此從轉化(Translational science)的角度去分析種屬差異就顯得十分必要了。舉個例子,在篩選入腦化合物的時候,大鼠SOA(Short oral absorption)實驗是最常用到的動物模型,通過比較化合物在大腦與血液的濃度比值來判斷其入腦程度。如果化合物的被動擴散較好,例如Papp > 5*10-6 cm/s,也並非人P-gp底物,但在該模型中並未發現在大鼠中有足夠的腦部暴露,很可能的原因是該化合物是大鼠P-gp底物,盡管P-gp在人和大鼠的同源性非常高[10]




4. CNS藥物研發中的DMPK評價


4.1 小分子化合物

4.1.1 理化性質

根據BBB的生理結構,我們其實比較容易推出入腦小分子化合物的一些基本理化性質要求,比如親脂性高、分子量不能太大、電負性低等,這些特性都是為了保證藥物分子能較為容易地自由透過BBB。Mahar Doan[11]總結了48個CNS和45個非CNS(non-CNS)小分子化合物的理化性質方面的區別(表2、3),可以看到脂溶性(CLogP和CLogD)、氫鍵供體數(hydrogen bond donor)以及可旋轉鍵數(rotatable bond)上兩類化合物有顯著性區別,脂溶性方面CNS藥物對比非CNS類更高。同時,與理論相符的是CNS藥物的滲透性(Papp)更高,是P-gp底物的概率也更低。


表2 CNS與非CNS藥物理化性質的比較

另外,對於需要轉運體參與的藥物分子,目前對於其理化性質還沒有一個成熟的評價體系和標準,或者說還較難通過主動設計讓化合物能與這些轉運體結合,只能case-by-case來分析了。


4.1.2 滲透性

BBB的生理結構導致其致密度較高而滲透性較差,因此要求化合物的滲透性或者說透膜性更強。評價藥物分子透膜性我們經常用到的體外模型有Caco-2單細胞層模型、MDCK-WT以及MDCK-MDR1模型,Papp(Apparent permeability)是具體的評價參數。


對於口服藥物,要求其能夠穿過腸細胞膜後到達全身血液系統,圖3表明Papp大於1*10-6 cm/s就能使得60%以上的藥物被吸收,超過10*10-6 cm/s的話80%以上的藥物分子能被吸收。


圖3 Caco-2滲透率與人體腸道吸收百分比之間的關系
圖片來源:cyprotex “Everything you need to know about ADME (3rd Edition)”


相對於藥物分子在腸道的滲透性,對其在BBB的要求就更高了,在CNS項目中一般希望能在10*10-6 cm/s以上,最好是能高於25*10-6cm/s,原因在於:1)相對於腸道,血管-大腦藥物濃度梯度低很多;2)大腦的蛋白結合率一般來說相對更高;3)相對於其他組織,因為有TJ存在,藥物分子在腦部血管缺乏細胞間轉運,同時也缺乏具有空隙的毛細血管;4)藥物分子在腦部的血管滯留時間更短,以秒計。

表3總結了幾個臨床CNS藥物的在MDCK-MDR1細胞上測得的Papp數值[12],可以看到絕大部分CNS藥物外排率(Efflux ratio,ER)都小於4,Papp都在5*10-6 cm/s以上。但對於地昔帕明(desipramine)和多西拉敏(doxylamine),可以看到其ER分別為6和11,提示為P-gp底物,但目前未有證據表明Doxylamine為P-gp底物。Desipramine盡管是P-gp底物,但因其被動擴散能力較強(Papp=5.56*10-6cm/s),因此也能透過BBB入腦。


表3 部分CNS藥物的體外滲透性以及外排率

4.1.3 外排轉運體

我們都知道,在BBB上高表達的P-gp和BCRP等外排轉運體是導致很多藥物分子,例如化療藥,無法穿過BBB進入大腦的原因,因此,在早期藥物篩選中需要剔除掉這類外排轉運體底物的化合物分子。目前臨床前對於外排轉運體主要是評價P-gp和BCRP,其細胞模型主要為MDCK-MDR1和MDCK-BCRP。


評價藥物分子是否為外排轉運體的底物,通常會用外排率(Efflux ratio,ER)來評價。ER的具體實驗測量本文不再贅述,大家可以參考以下網址(www.cyprotex.com/admepk/in-vitro-permeability/p-gp-substrate-identification,www.cyprotex.com/admepk/in-vitro-permeability/bcrp-substrate-identification)。


以P-gp為例,如果ER高於2說明化合物是該轉運體的底物(但正如表3所示,一些藥物分子體外實驗測得的ER高於2,但並不是P-gp的底物,也能入腦,究其原因可能是體外細胞模型還不能完全反映體內),其中對於CNS項目來說,要求其P-gp的ER小於2,即化合物不能是P-gp的底物,但對於BCRP而言,一般來說由於其在BBB上的外排作用相較於P-gp更弱,因此ER可以放寬至小於5。


此外,由於P-gp和BCRP在BBB上是共表達的,都參與到藥物分子的外排,因此MDCK-P-gp/BCRP雙表達模型也被很多公司采用,能同時將兩個外排轉運體的作用一起體現出來[13]

 
4.1.4 攝入轉運體

關於攝入轉運體,前面也提到過在肝細胞中大量表達的OATP家族也在BBB上有表達,特別是OATP1A2,研究發現其在腦部的表達量甚至高於肝臟[14],因此能夠幫助一些藥物分子入腦[15]


但目前,專門針對於這類轉運體(並非營養或者內源性物質轉運體)開發的入腦藥物就筆者了解是沒有的,原因在於:1)總體來說,腦部OATP家族的表達量相對於肝臟還是很少的,這點直接決定了藥物入腦的量不會太高;2)因為是OATP的底物,該類藥物的肝臟清除可能會比較大,也會相應地減少藥物入腦的總量;3)從藥物分子設計的角度來看也很難設計這樣的分子專門針對此類轉運體。例如抗血脂他汀類藥物絕大部分都是OATP底物,其入腦能力取決於本身理化性質與轉運體攝入,Lovastatin和Simvastatin已在臨床證明其可以入腦,但Pravastatin和rosuvastatin在臨床上卻並沒有發現有明顯的入腦能力[16]

 
4.1.5 體內評價

從化學家那裏拿到一個化合物分子後,從DMPK角度來說一般會先評價其理化性質,如溶解度、LogP等,如果沒有明顯缺陷的話下一步會對其滲透性和是否是P-gp底物進行評價(一般來說這兩個實驗是一起做的,MDCK-WT vs MDCK-MDR1),如果其Papp能達到5*10-6 cm/s以上,又不是P-gp底物,體外代謝穩定性也還不錯,那接下來會安排體內PK評估。相對於只采集血漿的常規PK,為了能評估腦內藥物暴露量,大鼠SOA實驗通常會被使用,即在每個采血時間點采集動物的肝門靜脈血、外周循環血以及大腦,目的是既可以評估常規PK,又可以得到肝提取率(Hepatic extraction,Eh,即1減去外周循環血與肝門靜脈藥物AUC比值)以及監測腦部藥物濃度,判斷藥物分子是否能入腦。


3.4節已經提到了Kp,uu這個概念,一般而言這個參數就是通過SOA實驗計算出Kp,再乘以fu,brain與fu,blood比值得到的,比如該參數如果為0.5,說明血管中一半的遊離藥物能進入穿過BBB進入大腦。對於不同公司來說,CNS項目中對Kp,uu的要求可能不盡相同,筆者了解到的采用0.5和0.3作為閾值的都有,但一般最後得到的PCC(Preclinical candidate)化合物其都在0.5以上。


:1)Kp,uu概念的提出是基於“遊離藥物理論”,即只有遊離的藥物才能發揮藥理作用。2)fu,brain的計算方式有多種,例如常規的組織勻漿測定以及更為精確的腦微透析(Microdialysis)。

 
4.1.6  實例

4.1.6.1  通過被動擴散(Passive diffusion)直接入腦

中樞神經系統腫瘤,例如原發性膠質母細胞瘤以及腫瘤腦轉移等,在中國乃至全世界範圍內都存在巨大的未滿足臨床需求,急需有效的治療方法。腦部腫瘤藥物開發的主要挑戰之一是大多數藥物難以透過血腦屏障。腦轉移是指原發於身體其他部位的腫瘤轉移至腦部,是臨床上最常見的CNS惡性腫瘤之一,具有顯著的發病率和死亡率,其發病率約為原發性腦部腫瘤的10倍。


據統計,約10%的惡性腫瘤確診患者在進展過程中會發生腦轉移,不同原發性腫瘤發生腦轉移的幾率具有顯著差異,最常見易發腦轉移的原發腫瘤為肺癌、乳腺癌和黑色素瘤。下文會就治療腦轉移藥物的開發舉兩個典型的例子,即阿斯利康公司開發的奧西替尼和AZD3759。


4.1.6.1.1   奧希替尼

奧希替尼(Osimertinib,AZD9291)作為第三代EGFR抑制劑,能克服第一代出現的T790M耐藥,目前已經廣泛用於一線以及二線EGFR突變的非小細胞肺癌治療,其在腦轉移病人上也取得了良好的效果。表4總結了不同EGFR抑制劑在小鼠SOA模型上的入腦情況[17],可以看到相對於一代吉非替尼(Gefitinib)、二代阿法替尼(Afatinib)和三代Rociletinib(CO-1686),奧西替尼表現出更為出色的入腦能力,其最高濃度(Cmax)下的Kp可以達到3.41(當然最後需要經過fu的校正得到Kpuu),為吉非替尼十數倍。


表4 不同EGFR抑制劑在小鼠模型中的入腦比較
:BLQ (below limit of quantification):低於定量下限


盡管在臨床前動物模型中吉非替尼和阿法替尼都並未發現有理想的入腦能力(Kp<0.25),但從絕對數值上看吉非替尼的表現還是優於阿法替尼的(見表4)。

臨床研究也證實了這點,吉非替尼和另一個一代EGFR抑制劑厄洛替尼(Erlotinib)的CSF的藥物濃度遠高於阿法替尼(見表5[18]。藥物的入腦情況也如預期體現在了臨床療效上,阿法替尼在腦轉移病人上的療效低於入腦能力更強的吉非替尼和厄洛替尼,如響應率(response rate,RR)35%vs ~80%,無進展生存期(progress-free survival,PFS)4個月 vs > 6個月(表6[18],盡管不同的研究這樣直接比較臨床療效是不夠準確的,但還是能看出大致的療效區別。

前文也提到腦部腫瘤對於BBB的破壞,所以盡管吉非替尼並未在臨床前表現出能達到CNS藥物的標準,其在臨床上還是被證明能給腦轉移病人帶來獲益,當然相對於奧西替尼藥來說臨床療效要差一些。

表5 不同EGFR抑制劑臨床入腦比較

表6 不同EGFR抑制劑在腦轉移患者中的療效比較


4.1.6.1.2    AZD3759


2016年AZ中國研發中心在SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE雜誌上介紹了其入腦EGFR抑制劑,AZD3759,用以治療EGFR突變的非小細胞肺癌腦轉移[19]。AZD3759理論上應該劃歸為一代EGFR抑制劑,因為其對T790M突變無效。作為入腦化合物,AZD3759有較高的滲透性,其Papp值達到29.5*10-6 cm/s,也不是P-gp和BCRP的底物,因此能很好地透過BBB進入腦內發揮作用。


與第一代EGFR抑制劑厄洛替尼相比的話,AZD3759在臨床前小鼠模型上顯示出更為出色的入腦能力,其Kpuu,brain達到0.6以上(表7),也直接帶來更好的腦內腫瘤的控制能力(圖4)。


表7 AZD3759與厄洛替尼在裸鼠模型中的藥代比較


:erlotinib的fublood和fubrain分別為3.15%和3.02%;AZD3759的fublood和fubrain分別為9.6%和2.2%

圖4  AZD3759與厄洛替尼臨床前藥效比較

需要指出的是,AZD3759在其他物種,包括小鼠和猴上都顯示出很好的入腦能力,其Kpuu,brain和Kpuu,CSF均在0.5以上。這種在臨床前不同物種上表現出一致的高入腦能力也為臨床開發奠定了信心,最終臨床發現也顯示,人體Ctrough,CSF值能達到或超過臨床前IC50水平,並給患者帶來了臨床獲益[20]
 
4.1.6.2  通過轉運體/受體介導的(Transporter/Receptor-mediated)入腦

除了開發能直接透過BBB化合物分子外,研究人員也希望通過腦血管內皮細胞表面的轉運體/受體介導藥物轉運來提高腦組織中藥物濃度。研究發現,在腦血管內皮細胞上存在多種轉運體和受體,如LAT1、轉鐵蛋白受體(TfR)和胰島素受體等。


之前,基於提高BBB滲透率的藥物開發策略其效果並不理想,因此使用血腦屏障內源轉運系統看似是一種合理的手段,這種方法可以用來調控藥物的轉運,且不破壞血腦屏障完整性。


依照類型,內源性血腦屏障轉運系統可分為:載體轉運(Carrier-mediated transport,CMT)、主動運輸(Active efflux transport,AET)和受體介導轉運(Receptor-mediated transport,RMT)(圖1)。


載體轉運體和主動運輸體系統,負責血液和腦組織之間小分子運輸,如葡萄糖、氨基酸、脂肪酸、核苷等。受體介導轉運體系統,負責特定內源性大分子的跨血腦屏障轉運,如胰島素、轉鐵蛋白、低密度脂蛋白、胰島素樣生長因子、瘦素等。


血液系統中的分子可以與BBB表面特定受體結合,結合後,通過受體介導作用,復合體分子穿過血管內皮細胞進入大腦。需要強調的是,轉運蛋白介導的胞吞作用是底物選擇性的,因為只有那些結構與內源性載體底物最為相近的藥物才會被吸收並轉運到大腦中。


受體介導的胞吞作用被認為是針對腦靶向藥物遞送的最成熟的策略之一,具有高特異性、選擇性和親和力的特點,盡管配體可能對體內穩態產生影響,而天然配體可能與藥物配體競爭降低靶向效率。


4.1.6.3   LAT1

LAT1是溶質轉運蛋白(Solute carrier,SLC)超家族成員,通常高表達於BBB,參與氨基酸的轉運。此外,研究也發現該轉運體在大多數侵襲性惡性腫瘤中也有極高的表達,例如多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)、乳腺癌、肺癌和黑色素瘤等[21]


上個月南通本草八達醫藥科技有限公司,一家專注於開發靶向SLC藥物的新創公司,宣布其自主研發的新藥NBQ72S治療晚期惡性腫瘤的一期臨床試驗完成首例患者給藥(www.prnasia.com/story/286174-1.shtml)。


NBQ72S是一款靶向人LAT1的新型小分子藥物,經由LAT1轉運高效、主動地透過血腦屏障轉運至大腦,並選擇性地進入LAT1高表達的腫瘤細胞,同時也使得通常不表達LAT1的正常組織免受損傷。


在腫瘤細胞內,NBQ72S通過幹擾快速分裂的腫瘤細胞的DNA復制發揮其細胞殺傷活性,從而殺死腫瘤。此外,因為LAT1在大多數腫瘤細胞中也大量表達,所以理論上LAT1靶向藥在系統性以及腦部相關腫瘤的治療中都會有療效。

 

4.1.6.4  轉鐵蛋白受體1(TfR1)


關於轉鐵蛋白受體的研究較多,其功能是參與鐵的轉運。


從機制上來說,結合了鐵的運轉蛋白(Fe-Tf)與血管內皮細胞表面的TfR結合,然後Fe-Tf-TfR復合物經過細胞的內吞作用形成內吞體,內吞體在內皮細胞內pH值降至5.5左右時釋放出所結合的鐵,在酸性pH下失去鐵的轉鐵蛋自(apo-Tf)仍與TfR結合並一起返回到細胞表面,在生理pH值環境下apo-Tf與TfR分離,apo-Tf回到循環系統再結合鐵,從而完成向腦組織運送鐵的循環[22]


同時,跟LAT1類似,由於鐵的需求增加,癌細胞例如GBM細胞也表達高水平的TfR1,因此TfR1已被證明是治療癌症的潛在靶標。


 4.2  單抗

艾伯維德國研發中心主管Alfred Hahn博士說到“僅僅低於5%的小分子藥物可以穿透血腦屏障,生物藥物幾乎不可能穿透血腦屏障”。


相對於小分子化合物,像單抗這類分子量巨大的藥物是無法直接穿過BBB到達腦部的,因此,對於CNS抗體類藥物的開發,其主要策略是:1)間接發揮療效,例如在抗體在多發性硬化症(MS)上的治療一般都是通過抑制外周免疫反應而實現的;2)通過表達在BBB上的受體內吞,設計雙靶點抗體(Bi-specific antibody),即一段靶向BBB上的轉運蛋白或受體,另一端靶向疾病靶點。


例如,羅氏使用的“Brain Shuttle”技術,通過觸發RMT過程將分子運輸到大腦中,例如靶向TfR。加拿大的Angiochem公司開發的一種抗體藥物ANG4043,能夠成功穿過患者的血腦屏障殺死癌細胞,被設計用於治療乳腺癌。研究人員在臨床前研究中發現,這種抗體能夠結合低密度脂蛋白相關受體1(Low-density lipoprotein receptor-relatedprotein-1,LRP-1),從而穿過血腦屏障。


最近單抗藥物在AD治療上有巨大的突破,即anti-aβ抗體aducanumab被FDA授予優先上市申請,盡管對其療效還存在較大的爭議。據報道,aducanumab區別於其他臨床失敗的anti-aβ抗體在於其天然就能夠跨越血腦屏障進入腦實質[23],但具體原因還未知,可能也是RMT介導,也有可能是高濃度的抗體藥物能直接破壞BBB的完整性[24]


總體而言,相對小分子化合物,DMPK在單抗藥物篩選和開發中發揮的作用有限,因此本文不贅述,感興趣的話可以參考這篇文獻[4]


 4.3  藥物入腦預測

目前對CNS藥物是有著巨大臨床需求的,但困難是CNS藥物研發挑戰性很大,其中一個需要解決的問題就是如何找到一種方法能在臨床前對CNS藥物的作用進行準確預測


目前來說我們對於精確預測CNS藥物作用的認識還存在很多空白,也缺乏對腦部藥物分布的充分了解。


但隨著計算科學的不斷發展,對於藥物入腦能力的預測,或者說Kpuu的預測目前已經有一些方法了,包括:1)QSAR模型,即將Kpuu與藥物的理化性質如分子量、LogP、PSA以及藥物特性如Papp、PPB等聯系起來;2)基於生理學的藥代動力學(Physiological-based pharmacokinetic,PBPK)法;3)PK/PD法。鑒於在制藥工業更為廣泛的應用,本文將重點介紹一些PBPK和PK/PD法。


4.3.1 PBPK法

先簡單介紹一下什麽是PBPK。PBPK通過整合人體生理系統參數、藥物理化性質和機制性藥代動力學數據以提早預測人體內的藥物藥代動力學特征。荷蘭萊頓大學(Leiden University)的Elizabeth C.M. de Lange教授在運用PBPK模型預測CNS藥物腦部暴露量方面有著非常深入的研究,因此,本小結將主要以de Lange教授實驗室的工作來對PBPK模型預測藥物腦部暴露量進行介紹。


圖5所示,類似於其他PBPK預測的過程,需要先在臨床前動物模型上對藥物在生物體內的PK過程進行驗證,然後再轉化到人。為了更精確地得到腦部遊離藥物濃度,在實驗操作中采用了微透析(Microdialysis)法。鑒於在臨床實際中一般無法直接對腦部藥物濃度進行測量,但可以對藥物在腦脊液(Cerebrospinal fluid,CSF)中進行實時監測,因此,可以建立“腦-腦脊液”藥物濃度關系來預測腦部濃度。


在該PBPK模型中,將腦部劃分為側腦室(lateral ventricle)、小腦延髓池(cisterna magna)以及蛛網膜下腔(subarachnoidal space),通過測量不同區域的CSF與腦細胞間液(brain extracellular fluid,brainECF)的藥物交換,最後在大鼠上建立起根據CSF藥物濃度來預測腦部藥物濃度的PBPK模型,然後轉化到人,即在臨床上通過測量CSF中的藥物濃度來預估腦部藥物濃度。


圖5 PBPK模型預測腦部藥物濃度


4.3.2  PK/PD模型:藥物濃度-受體占有率

相比較於傳統的由最低藥物濃度(Cmin)或AUC驅動的藥效(Pharmacodynamics,PD)來說,CNS疾病因其機理的復雜性往往無法直接得到明確的暴露量-藥效關系(Exposure-efficacy relationship,E-R),特別是對於離子通道等靶點。對於此種情況,受體占有率(Receptor occupancy,RO)理論往往能得到較好的應用。


例如,強生公司開發的右旋氯胺酮(S-ketamine)用以治療重度抑郁症(Major depression disease,MDD),其可能的靶標為NMDA受體(N-methyl-D-aspartate receptor),是離子型谷氨酸受體的一個亞型。S-ketamine作為一種新型抗抑郁藥物區別於傳統藥物如選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(Selective Serotonin ReuptakeInhibitors,SSRI)的地方在於其具有快速起效以及長時間有效這兩個特征上。


作為雙重門控通道,NMDA受體的調控很難通過傳統的Cmin或是AUC模型來解釋。為此,研究者們采用了受體占有率機制來解釋該藥的起效機制[25],首先在大鼠模型上構建了RO與藥物濃度(包括血液和腦部)的關系,如圖6所示。然後根據該模型推導出臨床劑量下Ketamine在腦部的NMDA受體占有率,結果表明臨床劑量下的最大RO值為30%(圖7),提示Ketamine對於NMDA受體只需要達到較低水平的調控即可發揮療效。


圖6  NMDA受體RO與藥物濃度關系

圖7  NMDA受體RO-藥物濃度-時間關系



5.展望


為使更多的藥物能進人腦組織,發揮更好的療效,研究人員采取了多種方法來增加藥物對BBB的通透性。用於臨床治療的第一個方法是BBB破壞法(blood-brain barrier disruption,BBBD),即頸內動脈注射高滲糖溶液,通過滲透作用吸出腦血管內皮細胞中的水分使其收縮,從而使TJ開放,BBB通透性增加。但BBBD具有侵襲性,即使在周圍血循環中無毒的白蛋白進入腦組織後也會引起嚴重的後果,也因其副作用大而逐漸退出了大眾視野。


受體和載體介導藥物轉運的優點是其能采取靈活的治療方案,但由於受到治療藥物能否與受體和載體特異性結合,以及受體和載體的數量及轉運能力的限制,目前僅有很少一部分治療藥物可通過這一方法轉運到腦組織,但該領域的研究也還是受到了廣泛關注。


另外需要特別強調的是,對於CNS疾病的治療,我們不能把思路局限在藥物分子一定要透過BBB才能發揮藥效這個假設上,實際上,就如前文提到的很多大分子抗體藥物其實是作用於外周靶標從而間接治療腦部疾病的,再舉一個目前CNS領域可以說是討論得最為火熱的例子,即綠谷制藥的抗AD藥物“GV-971”,一種來源於海藻的寡糖類藥物。因其分子量大以及極性高等特征,理論上是無法穿過BBB到達大腦的(從該藥的目標人群上看應該也不會有大幅度的BBB滲漏)。因此,在其發揮療效的機制研究上,研究人員另辟蹊徑從腸道微生物的角度對其進行了研究,最終也確實找到了能夠很好支撐其療效的理論依據[26]


最後,隨著生物技術的蓬勃發展,老的機理也越來越多地被發現是錯誤的或者不是唯一的,所以誰又能保證說像奧西替尼這樣的被公認為是通過抑制EGFR從而發揮藥效的藥物沒有其他的機制呢,比如說腸道菌群,比如說免疫反應。因此,筆者始終相信對於生物體的探索永遠都是沒有盡頭的,需要沉下心來以科學的態度和方式不斷探索和修正。


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