ADC非臨床安全性考量

清風 生物前哨


隨著最近多個ADC的批準, ADC正在成為一類極有前途的生物制藥抗癌藥物。從非臨床安全性的角度來看,由於ADC結合物的復雜性,既包括小分子又包括大分子成分,從而對標準的毒理學測試提出了獨特的挑戰。這就要在進行進行人體試驗前需要一種以科學為導向的安全性評估方法來進行非臨床安全性評估。本文就ADC的非臨床安全性考量做一個簡單介紹。


影響ADC安全的獨特特性


ADC具有其獨特的生化特性,與單個成分相比,其顯著改變了ADC的安全性(表1)。ADC的獨特特征之一是PK譜;結合顯著影響非結合組分的半衰期、清除、消除和生物分布。未結合抗體涉及分解代謝和靶標介導的清除途徑,而小分子彈頭通常通過肝臟和腎臟途徑清除。ADC的清除涉及到大分子和小分子的性質。結合物首先通過分解代謝以產生ADC代謝產物,或者進行去結合以產生裸抗和彈頭成分。一旦被分解,抗體就會被降解成氨基酸,供循環使用,而彈頭則會經歷腎臟和肝臟的清除。這種消除的差異會影響ADC的半衰期。未結合的單抗的半衰期一般為1至3周,而ADC的半衰期一般僅為2至5天。這種對半衰期的影響與ADC的整體穩定性有關。結合物可以將彈頭的半衰期從幾個小時延長到幾天。非結合組分的生物分布也受到結合作用的顯著影響。抗體主要局限於血漿空間,擴散到組織中的速度很慢,而小分子彈頭的分布體積通常要大得多。而結合後則將彈頭限制在血漿和抗體靶向的細胞和組織。


表1. ADC的獨特特性


靶上毒性


理想的ADC靶點是在腫瘤細胞上高表達,在正常細胞上低表達或不表達。然而,在現實中,幾乎所有的靶蛋白都有一定程度的正常組織表達,這可能是ADC發展的主要障礙。靶上毒性的一個眾所周知的例子是bivatuzumab mertansine,一種與DM1結合的抗人CD44v6抗體。IHC顯示CD44v6表達於角質形成細胞和角膜及扁桃體上皮細胞。在觀察到劑量依賴的皮膚毒性後,bivatuzumab mertansine的Phase 1試驗被停止,最終導致一例毒性表皮壞死松解的死亡病例。這種以角質形成細胞凋亡和脫屑為特征的發現被認為與皮膚中CD44v6的表達有關;其他DM1 ADC在臨床上沒有表現出類似的毒性。然而,僅根據表達模式很難預測On Target的潛在毒性(表2)。對於Kadcyla®(T-DM1),臨床試驗中觀察到的主要劑量限制毒性是血小板減少和肝酶升高,盡管靶標表達在胃腸道、肺、皮膚和乳房的心肌細胞和上皮細胞。從這個例子中可以清楚地看出,靶標上的毒性不僅僅是由靶標表達驅動的,而其他因素--例如增殖/靶細胞/器官的再生潛力、彈頭的機制/效力以及ADC對靶細胞的可及性也可能會發揮作用。


表2. ADC介導的靶上和靶外毒性臨床應用實例


靶外毒性


靶外毒性是指在不表達靶點的器官/細胞中發現的副作用。這些毒性一般與彈頭的毒性有關 (表3)。靶外毒性是臨床開發中ADC劑量限制毒性(DLT)的主要原因。最初,與微管抑制劑結合的大多數ADC的最大耐受量(MTD)在2至5 mg/kg之間,與靶標表達無關。因此,人們迫切希望提高下一代ADC的治療指數,而這只有通過更好地了解靶外毒性的潛在機制才能實現。靶外毒性的兩個主要機制被認為與(1)結合穩定性和(2)對正常細胞的非特異性攝取有關。


表3. ADC的常見劑量限制毒性


關於結合物不穩定性,即將彈頭釋放到目標細胞外,增加全身暴露而導致靶標外毒性。影響ADC穩定性的兩個主要因素是連接物的選擇和用於將彈頭連接到抗體上的偶聯化學方法。


連接器不穩定被認為是第一代ADC失敗的主要原因--包括第一個上市的ADC Mylotarg®。理想的連接物應該足夠穩定,可以將ADC運送到腫瘤部位,但又足夠不穩定,可以在細胞內迅速釋放彈頭。當代連接子被分類為可切割或不可切割。大多數可切割連接子被設計為在低pH環境中被酶選擇性切割,例如溶酶體。這一方法已得到Adcetris®的臨床驗證,它使用一種可切割的二肽連接物,在溶酶體內經歷組織蛋白酶B的切割。不可切割的連接子必須在細胞內經歷分解代謝才能釋放彈頭。雖然與可切割連接子相比,這些連接子一般表現出更好的安全性,但對治療指數的影響是不同的,因為在需要旁觀者效應的異質性靶表達的腫瘤類型中,不切割ADC的活性通常較低。目前,接頭選擇/腫瘤類型/療效/安全性之間的關系尚不清楚,最佳接頭-彈頭組合必須針對每個ADC進行測試。


影響穩定性的另一個因素是用於將彈頭連接到抗體上的結合化學類型。最常見的偶聯方法是將藥物通過馬來酰亞胺基團結合到抗體半胱氨酸或賴氨酸殘基上。這個過程也被稱為隨機結合,產生藥物抗體比率(DAR)從0到8的不同種類的ADC混合物。研究發現,在相同的抗體劑量下,較高的DAR ADC比較低的DAR ADC毒性更大。這種影響被認為與更快地清除有關。結合化學的最新進展導致了具有均勻載藥量和改善穩定性的ADC的生產。這些技術使用非天然氨基酸、工程半胱氨酸或轉谷氨酰胺酶將彈頭連接到抗體上的特定位置。研究表明,與隨機結合的DAR4 ADC相比,使用位點特定結合產生均一的DAR2 ADC的治療指數有顯著的改善。這些位點特異性的ADC對大鼠和猴子的毒性較低,同時在腫瘤異種移植模型中保持了同等的活性。


雖然ADC對正常細胞的靶非依賴性攝取被認為是靶外毒性的主要組成部分,但關於這方面的毒性機制依然不是十分清晰。抗體被正常細胞以不依賴於抗原的方式攝取的機制有很多,包括Fc受體介導的攝取(如甘露糖受體、FcRn和FcγR受體)、非特異性內吞作用和攝取ADC分解代謝產物等。理論上,非特異性攝取可以導致ADC通過內體或溶酶體途徑在細胞內轉運,隨後在正常細胞內釋放細胞毒彈頭。然而,目前很少有數據來評估抗原非依賴性攝取對ADC整體非靶點毒性的影響。支持這一假設的最廣泛的數據來自一項研究,該研究旨在調查T-DM1介導的血小板減少的機制。這項研究是在觀察到盡管缺乏對血小板或血小板前體的靶向表達的情況下,T-DM1患者中劑量限制性血小板減少症的高發生率之後開始進行的。用富含血小板的血漿進行的初步體外研究表明,T-DM1對血小板沒有直接影響。然而,巨噬細胞培養的後續研究表明,Alexa488結合的T-DM1在血小板前體中的表面結合和內化。FcRγIIb似乎在非特異性攝取中發揮作用,因為與抗CD32抗體預先孵育使Alexa488結合的T-DM1的內化減少了近兩倍。然而,Fcγ受體阻斷實驗並沒有完全阻止巨噬細胞攝取,這表明還有其他非Fc受體機制參與其中。


當前監管機構對ADC的預期

目前還沒有專門針對ADC的非臨床安全性測試的監管指南。目前的指導僅限於ICHS6(R1)和S9中的小部分。這些文件中涉及的主要原則是物種選擇、穩定性(體外和體內),以及測試結合和非結合物的重要性(表4)。


關於ADC安全評估的監管指南


物種選擇


ICHS6(R1)概述了物種選擇的原則。一般來說,結合抗體的物種選擇應使用與非結合抗體相同的方法--即毒性研究應僅在具有抗體交叉反應的相關物種中進行。在嚙齒動物不是相關物種的情況下,安全評估可以限制在是非人類靈長類動物。如果ADC確實結合了嚙齒動物和非嚙齒動物的靶標,則必須對兩個物種同時進行毒理學研究。對於未結合的單抗,在不相關的物種中進行的研究--即沒有靶標交叉反應--被認為具有誤導性,不被鼓勵。這是因為與治療性單抗相關的大多數毒性與主要藥理靶點的過度調節有關。然而,對於ADC來說,這一論點並不成立。高威力的細胞毒性彈頭的存在產生了與靶標結合無關的顯著毒性。因此,在非交叉反應物種中進行的毒理學可以提供非靶標毒性的相關信息,並有可能被用於指導臨床試驗設計和開始劑量。


穩定性


如前所述,連接器穩定性是影響ADC安全性的最重要因素之一。這反映在ICHS6(R1)和S9指南中,它們規定ADCs的穩定性和代謝穩定性應該在人類和受試物種血漿中研究。雖然評估ADC穩定性的科學最佳實踐尚未建立,但在體外穩定性評估中,通常通過確定37℃持續3至7天的人體和受試物種血漿中DAR的損失來評估。除了體外實驗法外,還必須通過測量受試物種中ADC及其未結合組分的血漿水平來進一步評估ADC的穩定性。雖然ICHS9明確指出,ADC的毒代動力學評價應同時評估結合化合物和非結合化合物,但它沒有具體說明必須測量哪些單獨成分。從資源的角度來看,在非臨床開發的早期開發和驗證多種生物分析是非常具有挑戰性的。最好的評估方法是至少測量總ADC、總單抗(結合和非結合的)和彈頭(可切割的ADC)±接頭(不可切割的ADC)。這使得能夠通過比較血漿中總mAb和ADC的濃度來計算去結合率。


測試結合物與非結合物的重要性


在目前的指南中,與ADC非臨床安全性評估相關的另一個具體原則是檢測結合蛋白的相對重要性。GLP毒理學研究中的非結合成分。ICHS6(R1)和ICHS9都清楚地表明,ADC應該是非臨床安全性評價的主要焦點。此外,兩項準則都表示,如果細胞毒劑以前已經過測試,並且有足夠的科學資料可用,則可可以不單獨評估非結合彈頭。對新型細胞毒性彈頭的非臨床安全性評估ICHS6(R1)建議應遵循用於新型分子實體(NME)的方法,在大鼠中評估彈頭的抗原非依賴性毒性。


用於ADC的IND申請所需的非臨床安全性研究在表5中概述,不在一一詳述。


支持ADC的IND和BLA申請所需的臨床安全性研究


小編小結


ADC是由細胞毒性小分子通過穩定的、可切割或不可切割的連接子與抗體共價連接而成的生物制藥分子。結合的過程產生了一個高度復雜的分子,其生化性質與非結合組分的生化性質不同。ADC的混合性質突出了安全評估需要一種以科學為基礎的方法。監管指南規定,應對該ADC進行全面的非臨床安全性評估,以支持使用ADC進行的首例人類臨床試驗。關鍵的GLP毒理學研究應在相關物種中進行,以評估潛在的靶標上和靶標外的安全風險。該研究應包括結合組分和非結合組分的毒代動力學分析,以評估穩定性對安全性的影響。還應該了解靶基因的表達,這可以從GLP TCR研究或現有的IHC數據中得出。所有的這些數據應該足以設定臨床起始劑量,並為臨床監測計劃提供信息。這些努力將使得行業和患者受益,增加下一代ADC臨床成功的機會。


參考文獻

1.Antibody Drug Conjugates: Nonclinical Safety Considerations.

2.A Brief Introduction to Antibody–Drug Conjugates for Toxicologic Pathologists.

3.Risk Minimization of Antibody–Drug Conjugates in Oncology: A Review.

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